Передовые технологии: Ветеринарная медицина

Опубликовать статью

Сравнительная оценка микробиологических и молекулярных методов выявления сальмонелл в кишечном содержимом у сельхозптицы

Вид Salmonella enterica включает в себя более 2500 сероваров, характеризующихся различной устойчивостью к антибиотикам, гостальной специфичностью, токсичностью, патогенностью, вирулентностью, природными резервуарами и т.д. В то же время идентификация серовара только иммунохимическими методами не представляется достаточно адекватной, т. к. патогенность внутри отдельного серовара сальмонелл может варьировать благодаря наличию плазмид, мутаций и рекомбинации в хромосомной ДНК. Изменение антигенной структуры сальмонелл может происходить за счет незначительных генетических изменений в относительно небольшом числе генов, и, соответственно, иммунохимические методы типирования не в полной мере отражают генетическую изменчивость того или иного изолята сальмонелл.

Целью исследования было усовершенствовать систему изоляции и типирования сальмонелл при мониторинге сальмонеллоноситества для свинокомплексов и птицефабрик.

Материалы и методы
Первичную изоляцию сальмонелл проводили на базе лаборатории болезней молодняка с.х. животных, лаборатории болезней птиц, ГНУ ИЭВСиДВ СО Россельхозакадемии, группы фармакогеномики ИХБиФМ СО РАН. Часть экспедиционных работ и сбор эпизоотологической информации выполнялась  ИВМ НГАУ.

Сальмонелл изолировали из различных объектов (пробы патологического материала, продукция животноводства и птицеводства, пробы кишечного содержимого). Для изоляции использовали селективные и элективные среды (среда Эндо, селенитовый бульон, висмутсульфитагар, среда XLT4). Культуры обладающие типичными для сальмонелл культуральными характеристиками дополнительно типировали на питательной среде урислелект 4 (BioRad) для исключения энтеробактеров, клебсиелл и протеев также растущих на висмутсульфитагаре. Идентификацию вида проводили с использованием биохимических тестов ПБДЭ «ДС Нижний Новгород» [1], секвенирование гена 16s рибосомальной РНК [2] и real-time ПЦР [3]

ДНК сальмонелл изолировали методом выделения со CTAB. Наличие гена SPVC контролировали методом ПЦР.    Данные обрабатывали c  использованием программ «Электронный журнал учета культур» (ГНУ ИЭВСиДВ), StatSoft 6/0, SPSS

Результаты собственных исследований и обсуждение
Всего было микробиологически исследовано 586 проб биоматериала. В результате получено 118 проб S.enterica. Материал отбирали на территории РФ (Красноярский край, Алтай, Новосибирская обл., Омская обл. Кемеровская обл., Томская обл.). Сальмонелл изолировали из различных внутренних органов кур, коров, страусов, голубей, свиней.

Обращает на себя внимание различная эффективность различных микробиологических методов выделения и первичной типизации сальмонелл. Так, при использовании следующей схемы: пептонная вода, селенитовый бульон, висмут-сульфитагар из желудочно-кишечного тракта и проб печени преимущественно изолировали P.vulgaris (64%), P.mirabilis (12%),  микроорганизмы рода Enterobacter 13% Pseudomonas (4%), и в остальных случаях Salmonella enterica (в среднем 7%, в кишечнике 1%). При этом высеваемость сальмонелл из проб печени была выше, чем из проб кишечного содержимого, что парадоксально т.к. кишечник является воротами инфекции и должен быть основным источником сальмонелл.

Очевидно, что наиболее негативным фактором, снижающим  чувствительность данной схемы выделения , являлась возможность роста на используемых средах других бактерий сем. Enterobacteriaceae напр. рода Proteus, Enterobacter.  В то же время использование методов ПЦР позволяло выявить более высокую инфицированность проб кишечного содержимого (таблица 1), тогда как, по результатам микробиологического метода инфицированность кишечного содержимого не превышала 1%.

Таблица 1 – Скрининг четырех птицефабрик Сибирского региона на носительство сальмонелл по результатам ПЦР.

Тип стада
Возраст птицы
Выборка
Материал
Процент положительных проб
Бройлеры
15 дн
6 проб
клоака
33,3%
Бройлеры до обработки флубактином
21дн
5+5 проб 2 разных корпуса
клоака
50%
Бройлеры после обработки флубактином
28 дн
4+4 проб
2 разных корпуса
клоака
0%
Родительское стадо
170 дн
8 проб
клоака
0%
Несушка
195 дн
10 проб
клоака
0%
 

Как следует из таблицы №1, уровень инфицированности по данным ПЦР анализа варьировал от 0 до 50%.

Недостатком традиционной схемы изоляции сальмонелл является тот факт что и селенитовый бульон и висмут-сульфитагар селективны в отношении грамм-отрицательных микроорганизмов активно продуцирующих сероводород (при этом посевная доза таких микроорганизмов должна быть высокой чтобы обеспечить подавление селектирующего агента). Соответственно высокая концентрация в пробе микроорганизмов рода Proteus защищает другие микроорганизмы путем редукции сульфитов до сероводорода.

Более эффективна была первичная изоляция на среде Эндо, при этом посевная доза сальмонелл может варьировать до единичных бактериальных клеток и этот фактор не влияет на выживаемость сальмонелл в данной среде. Однако при исследовании желудочно-кишечного тракта птиц данный метод оставался недостаточно эффективным ввиду возможности ползущего роста P.vulgaris по среде Эндо (данный микроорганизм всегда встречается в кишечном содержимом птиц).

Использование среды XLT4 позволило исключить негативное влияние микроорганизмов рода Proteus на рост сальмонелл при их первичной изоляции. При тестировании 34 проб кишечного содержимого на среде XLT4 было выделено 12 культур сальмонелл и ни одной культуры микроорганизмов рода Proteus. Схема изоляции была следующей; посев на среду Эндо на 16 ч, рассев бледно-розовых колоний на среде XLT4 инкубация 24-48 ч, посев штрихом на среды висмут-сульфитагар и уриселект-4 (для подтверждения продукции сероводорода и исключения триптофандезаминазной активности соответственно). В дальнейшем изоляты обладающие культуральными и тинкториальными характеристиками сальмонелл типировали иммунохимически, биохимически или ПЦР.

Таблица 2 – Сопоставление результатов детекции сальмонелл из толстого отдела кишечника цыплят-бролйеров

Схема выделения 1
Кол-во выделенных культур
Схема выделения 2
Кол-во выделенных культур
ПЦР
Кол-во положительных реакций
0
12
14
 

Как следует из таблицы 2 сопоставление традиционной схемы выделения (схема 1) и предложенной нами (схема 2) а также результатов ПЦР анализа показывает более высокую чувствительность предложенной нами схемы, сопоставимую с результатами ПЦР.

Заключение
Используемые в лабораторной практике схемы изоляции сальмонелл недостаточно эффективны для мониторинга сальмонеллоносительства в стадах сельскохозяйственной птицы в сравнении с результатами ПЦР исследований, однако при использовании современных схем изоляции сальмонелл микробиологические методы не уступают по чувствительности ПЦР-анализу.

Литература:

1. Определитель бактерий Берджи. Под ред. Дж. Хоулта. М. : «Мир». 1997

2. Jensen, M. A., J. A. Webster, and N. Straus. 1993. Rapid identification of bacteria on the basis of polymerase chain reaction-amplified ribosomal DNA spacer polymorphisms. Appl. Environ. Microbiol. 59:945-952

3. Афонюшкин В.Н., Дударева Е.В., Малахеева Л.И., Филипенко М.Л. Антибтотикорезистентность сальманелл в Сибири. //Ветеринария. 2008. 1, 7-9.

Афонюшкин В.Н., Юшков Ю.Г., Коптев В.Ю, Плотникова О.В.,
ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии
 
Филипенко М.Л., Дударева Е.В.,
ИХБиФМ СО РАН
 
Вольф В.Т., Шмаков Н.А.,
ФГБОУ ВПО «НГАУ»
 

Выражаем автору благодарность. Статья публикуется и удаляется самостоятельно по желанию автора. Публикация носит исключительно научно-ознакомительный некоммерческий характер и предназначена содействовать в популяризации имени автора, его работы среди широкого круга ученых и практиков АПК. Приводится в авторской редакции, ответственность за достоверность данных несет автор. Редакция вправе устранять грамматические и пунктуационные погрешности, а также корректировать верстку материала. Все права на картинки и тексты принадлежат автору, любое их воспроизведение возможно только с его разрешения. Для связи с автором используйте указанный им адрес электронной почты, либо обратитесь в редакцию журнала. При возникновении любых претензий относительно авторских прав, пожалуйста, немедленно сообщите в редакцию. По первому требованию автора любые его материалы будут немедленно удалены, а инцидент улажен. В научных работах и для ВАК на эту статью можно и необходимо ссылаться по ГОСТ Р 7.0.5 2008 (статья может быть обнародована не впервые)

УДАЛИТЬ СТАТЬЮ | ПОЖАЛОВАТЬСЯ | ЗАДАТЬ ВОПРОС
АгроПоиск - аграрная поисковая система
АгроПоиск - аграрная поисковая система