7–9 ноября 2018
Международная выставка сельскохозяйственной техники, оборудования и материалов для производства и переработки сельскохозяйственной продукции Получите электронный билет

Идентификация Bifidobacterium в заквасочных культурах при производстве кисломолочных продуктов

Переработка сельскохозяйственного сырья / 31 января 2014


Бифидобактерии являются одними из наиболее широко известных и используемых в производстве пробиотиков, которые используются при производстве кисломолочных напитков, а также при изготовлении сыров с пробиотической микрофлорой. Среди бифидобактерий чаще используют культуры Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium adolescentis.

Бифидобактерии являются одними из наиболее широко известных и используемых в производстве пробиотиков, которые используются при производстве кисломолочных напитков, а также при изготовлении сыров с пробиотической микрофлорой. Среди бифидобактерий чаще используют культуры Bifidobacterium longum, Bifidobacterium bifidum и Bifidobacterium adolescentis.

При производстве кисломолочных продуктов возникают проблемы в получении качественных заквасок, в состав которых входят культуры бифидобактерий. Невысокая скорость роста и неустойчивость при низкой кислотности среды, контакте с кислородом воздуха затрудняет их культивирование и выделение чистой культуры в лабораторных условиях. Поэтому необходим метод, позволяющий установить наличие или отсутствие этих бактерий в образце.

Высокочувствительные молекулярные методы, основанные на ДНК-технологиях, позволяют определять бифидобактерии в исходном субстрате, в накопительной и в чистой культуре. Однако большинство методов молекулярного анализа в настоящее время основывается на гене малой субъединицы рибосомальной РНК бактерий – 16S рРНК. Одним из способов выявления Bifidobacterium является ПЦР с использованием праймеров, подобранных на основе последовательностей 16S rRNA пяти видов Bifidobacterium: bifidum, adolescentis, infantis, breve и longum. С помощью данного метода можно выявлять не только род, но и вид данных бактерий с учетом точечных мутаций, характерных для рода и видов Bifidobacterium species. К недостаткам данного способа можно отнести то, что выявляется только род и вид Bifidobacterium и невозможна дифференциация на подвиды.

Цель наших исследований – разработать синтетические олигонуклеотидные праймеры для выявления ДНК Bifidobacterium longum subspecies longum, subspecies infantis, subspecies lactis, а также Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium adolescentis и Bifidobacterium breve в ПЦР на уровне рода, вида и подвида.

Исследованию были подвергнуты культуры Bifidobacterium, выделенные в разные годы в лаборатории микробиологии ГНУ СибНИИС Россельхозакадемии (г. Барнаул). Выделение ДНК осуществляли с помощью 10% SТАВ.

Поиск и выбор специфических праймеров осуществляли путем анализа полных геномов референтных штаммов Bifidobacterium представленных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ GenBank Search.html). Химический синтез праймеров осуществляли амидофосфитным методом на автоматическом синтезаторе ASM-102U (Biosset Ltd, Новосибирск). Концентрацию специфических олигонуклеотидных праймеров в маточном растворе определяли спектрометрическим методом.

Постановку ПЦР проводили на амплификаторах «Бис» М-105. О результатах судили по размеру синтезированного фрагмента ДНК, мигрирующего в 1,0%-м геле агарозы при силе тока 40 мА. В качестве маркера использовали ДНК pBLSKII(+)/ MspI. Результат ПЦР считали положительным, если продукт реакции соответствовал ожидаемому размеру фрагмента ДНК Bifidobacterium longum subspecies longum с праймерами Bill1F и Bill2R в 447 н.п., subspecies infantis с праймерами Bili1F и Bili2R в 362 н.п., subspecies lactis с праймерами Bial1F и Bial2R в 640 н.п., Bifidobacterium bifidum с праймерами Bibi1F и Bibi2R в 371 н.п., Bifidobacterium adolescentis с праймерами Biad1F и Biad2R в 546 н.п., и Bifidobacterium breve с праймерами Bibr1F и Bibr2R в 204 н.п.

Анализы были отрицательными, когда использовали ДНК других бактерий. Для подтверждения специфичности тестируемого фрагмента наработали фрагмент на матрице ДНК штамма Bifidobacterium longum subspecies longum ST (Коллекция ГНУ СибНИИС, Барнаул) и провели секвенирование. Анализ нуклеотидных последовательностей синтезируемых фрагментов провели методами выравнивания с другими опубликованными последовательностями полных геномов референтных штаммов Bifidobacterium longum subspecies longum, представленных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ GenBank Search.html). Установили, что рассматриваемая нуклеотидная последовательность штамма Bifidobacterium longum subspecies longum str. ST (коллекция ГНУ СибНИИС, г. Барнаул) совпадала с нуклеотидной последовательностью референтных штаммов Bifidobacterium longum subspecies longum.

Таким образом, разработаны синтетические олигонуклеотидные праймеры, обладающие специфичностью и позволяющие в полимеразной цепной реакции проводить выявление и идентификацию штаммов и культур Bifidobacterium longum subspecies longum, subspecies infantis, subspecies lactis, а также Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium adolescentis и Bifidobacterium breve, используемых в заквасочных культурах при производстве кисломолочных продуктов.

С. А. Юрик, В. И. Семенихин,
ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии,
п. Краснообск, Новосибирская область, Россия
 

Источник: BORONA.net



Другие статьи