Идентификация подвидов мезофильных гомоферментативных лактококков с помощью олигонуклеотидных праймеров

Переработка сельскохозяйственного сырья / 10 января 2014


При производстве сметаны, творога, некоторых сортов твердых сыров в качестве одного из компонентов бактериальной закваски используют мезофильныные гомоферментативные Lactococcus lactis. При типировании штаммов и изолятов Lactococcus lactis на подвиды применяют несколько методов, где основным является способ, основанный на изучении биологических и биохимических свойств и сопоставлении полученных данных с данными дифференциальной таблицы определителя микроорганизмов Берджи. Это позволяет определить видовую принадлежность тестируемых лактококков.

При производстве сметаны, творога, некоторых сортов твердых сыров в качестве одного из компонентов бактериальной закваски используют мезофильныные гомоферментативные Lactococcus lactis. При типировании штаммов и изолятов Lactococcus lactis на подвиды применяют несколько методов, где основным является способ, основанный на изучении биологических и биохимических свойств и сопоставлении полученных данных с данными дифференциальной таблицы определителя микроорганизмов Берджи. Это позволяет определить видовую принадлежность тестируемых лактококков.

В последующем рядом исследователей были использованы различные способы дифференциации лактококков, основанные на анализе ДНК гена 16S rRNA Lactococcus lactis. Так, были применены способы основанные на использовании RFLP (restriction fragment length polymorphisms) анализа синтезированного гена 16S rRNA c помощью специфических праймеров для Lactococcus lactis с последующим гидролизом эндонуклеазами. Специфичность полученных паттернов для subspecies cremoris и subspecies lactis подтверждалась гибридизацией в не радиоактивном варианте. Более четкие результаты по дифференциации подвидов Lactococcus lactis авторы получали, если в дополнение учитывали результаты электрофореза продуктов гидролиза аргинина, выделенного из бактерий, выращенных при 40ºС в присутствии 4% NaCL.

Целью наших исследований было разработать способ STSs-ДНК мономорфного маркирования нуклеотидных последовательностей при помощи специфических синтетических олигонуклеотидных праймеров в ПЦР с использованием в качестве молекулярной мишени ДНК гена транспозонов Lactococcus lactis subspecies lactis и Lactococcus lactis subspecies cremoris.

Исследованию были подвергнуты культуры Lactococcus lactis, выделенные в разные годы в лаборатории микробиологии ГБНУ СибНИИС Россельхозакадемии (г. Барнаул). Выделение ДНК осуществляли с помощью 10% SТАВ.

Выбор специфических праймеров 83F-83R и 12F-12R осуществляли на основе выбранных фрагментов ДНК, характерных соответственно для Lactococcus lactis subspecies lactis и subspecies cremoris, при анализе полных геномов референтных штаммов, представленных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ GenBank Search.html).

Постановку ПЦР проводили на амплификаторах "Бис" М-105. О результатах судили по размеру синтезированного фрагмента ДНК, мигрирующего в 1,0%-м геле агарозы при силе тока 35–40 мА. В качестве маркера использовали ДНК pBLSKII(+)/ MspI. Результат ПЦР считали положительным, если продукт реакции соответствовал ожидаемому размеру фрагмента ДНК subspecies lactis в 449 н.п., а фрагмента ДНК subspecies cremoris – в 334 н. п.

Для подтверждения специфичности тестируемых фрагментов ДНК, характерных соответственно только для Lactococcus lactis subsp. lactis, и Lactococcus lactis subspecies cremoris, провели секвенирование. Анализ нуклеотидных последовательностей синтезируемых фрагментов с помощью праймеров 83F-83R и 12F-12R провели методом выравнивания с другими опубликованными последовательностями полных геномов референтных штаммов Lactococcus lactis subspecies lactis и subspecies cremoris, представленных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ GenBank Search.html). Установили, что рассматриваемые нуклеотидные последовательности штаммов Lactococcus lactis subsp. lactis и Lactococcus lactis subsp. cremoris (коллекция ГНУ СибНИИС) совпадали с опубликованными нуклеотидными последовательностями референтных штаммов.

Таким образом, разработанные синтетические олигонуклеотидные праймеры 83F-83R и 12F-12R для выявления фрагмента ДНК, характерного только для Lactococcus lactis subsp. lactis и Lactococcus lactis subspecies cremoris обладают специфичностью и позволяют эффективно проводить идентификацию штаммов и культур Lactococcus lactis, используемых в заквасочных культурах при производстве твердых сыров и кисломолочных продуктов.

Юрик С. А., Семенихин В. И.,
ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии,
п.Краснообск, Новосибирская обл., Россия,
E-mail: vsemenikhin@mail.ru
 

Источник: BORONA.net



Другие статьи