Выявление термофильных гоферментативных лактобацил и стрептококков в заквасочных культурах с помощью ПЦР

Переработка сельскохозяйственного сырья / 17 февраля 2014


Йогурт – это кисломолочный продукт, произведенный с использованием смеси заквасочных микроорганизмов термофильных молочнокислых стрептококков (Streptococcus termophilus) и болгарской молочнокислой палочки (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus).

Йогурт – это кисломолочный продукт, произведенный с использованием смеси заквасочных микроорганизмов термофильных молочнокислых стрептококков (Streptococcus termophilus) и болгарской молочнокислой палочки (Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus).

Некоторые фирмы-изготовители стартерных культур для кисломолочных продуктов кроме участия Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus и Streptococcus thermophilus включают также Lactobacillus acidophilus. В этом случае данный состав формирует молочнокислый вкус и аромат, который уступает по качеству, вкусу и аромату оригинальному болгарскому кислому молоку и делает неразличимым вкус разных видов и ассортиментов кислого молока.

До настоящего времени основным способом типирования штаммов Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus является способ микробиологических исследований. Кроме этого применяется способ генотипирования, включающий синтез ДНК межгенной вставки 16S-23S rRNA с последующим гидролизом ее 11 эндонуклеазами и сравнение полученных паттернов с референтными штаммами. Этот прием позволяет различать почти все изолируемые культуры на уровне вида, но не подвида.

Для определения видовой принадлежности Streptococcus thermophilus применяется способ генотипирования по гену 16S rRNA. При этом осуществляется синтез и секвенирование последовательности гена 16S rRNA. Затем проводится сравнение последовательности данного гена с последовательностями, характерными для Streptococcus thermophilus из базы данных GenBank.

Определение видовой принадлежности Lactobacillus acidophilus является синтез с помощью ПЦР генов 16S rRNA при использовании праймеров, подобранных на основе разновидностей этих бактерий. Это позволяет выявлять вид данных микроорганизмов.

К недостаткам данных способов можно отнести необходимость проведения гидролиза и секвенирование ампликонов, сравнение каждого с базой данных GenBank и в результате длительность процесса тестирования и высокую стоимость.

Целью наших исследований было разработать способы маркирования нуклеотидных последовательностей при помощи специфических синтетических олигонуклеотидных праймеров в ПЦР с использованием в качестве молекулярной мишени ДНК гена repair factor характерного только для Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, гена transcriptional regulator характерного для Lactobacillus acidophilus и гена protein 2В характерного для Streptococcus thermophilus.

Исследованию были подвергнуты культуры выделенные в разные годы в лаборатории микробиологии ГБНУ СибНИИС Россельхозакадемии (г. Барнаул). Выделение ДНК осуществляли с помощью 10% SТАВ.

На основе выбранных фрагментов ДНК, при анализе полных геномов референтных штаммов, представленных в базе данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank), были синтезированы специфические праймеры Lbul4F и Lbul5R, Lacid1F и Lacid2R , Stt1F и Stt2R.

Постановку ПЦР проводили на амплификаторах «Бис» М-105. О результатах судили по размеру синтезированного фрагмента ДНК, мигрирующего в 1,0%-м геле агарозы при силе тока 35–40 мА. В качестве маркера использовали ДНК pBLSKII(+)/ MspI. Результат ПЦР считали положительным, если продукт реакции соответствовал ожидаемому размеру фрагмента ДНК: L. delbrueckii subsp. bulgaricus в 409 н.п., L. acidophilus в 412 н. п. и Str. thermophilus в 665 н. п. Для подтверждения специфичности тестируемых фрагментов ДНК, характерных только для L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. acidophilus и Str. thermophilus провели секвенирование. Анализ нуклеотидных последовательностей синтезируемых с помощью праймеров Lbul4F и Lbul5R, Lacid1F и Lacid2R , Stt1F и Stt2R фрагментов провели методом выравнивания с другими опубликованными последовательностями полных геномов референтных штаммов представленных в базе данных GenBank. Установили, что рассматриваемые нуклеотидные последовательности штаммов L. delbrueckii фрагментов bulgaricus, L. acidophilus и Str. thermophilus (коллекция ГНУ СибНИИС) совпадали с опубликованными нуклеотидными последовательностями референтных штаммов.

Таким образом, разработанные синтетические олигонуклеотидные праймеры Lbul4F и Lbul5R, Lacid1F и Lacid2R , Stt1F и Stt2R для выявления фрагментов ДНК, характерных соответственно для генов Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus acidophilus и Streptococcus thermophilus обладают специфичностью и позволяют проводить идентификацию вышеназванных штаммов и культур, используемых в заквасочных культурах при производстве твердых сыров и кисломолочных продуктов.

Семенихин В. И., Юрик С. А,
ГНУ ИЭВСиДВ Россельхозакадемии,
г. Новосибирск, Россия,
E-mail: vsemenikhin@mail.ru
 

Источник: BORONA.net



Другие статьи