Штамм бактерий Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum для изготовления диагностических и профилактических препаратов против некробактериоза
Ветеринарная медицина / 19 февраля 2014
За рубежом известен ряд штаммов бактерий вида Fusobacterium necrophorum, являющихся возбудителями некробактериоза у сельскохозяйственных животных – это Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum штамм FnS1 (CAA48747, NCIBI), а у людей – Fusobacterium nucleatum subspecies vincentii штамм ATCC49256 (ZP00143866, NCIBI) и Fusobacterium necrophorum subspecies funduliforme штамм JCM3724.
За рубежом известен ряд штаммов бактерий вида Fusobacterium necrophorum, являющихся возбудителями некробактериоза у сельскохозяйственных животных – это Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum штамм FnS1 (CAA48747, NCIBI), а у людей – Fusobacterium nucleatum subspecies vincentii штамм ATCC49256 (ZP00143866, NCIBI) и Fusobacterium necrophorum subspecies funduliforme штамм JCM3724.
При разработке тест-системы для выявления патогенных Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum мы столкнулись с тем, что в отечественной литературе не было описано ни одного штамма данного возбудителя. В своих работах ряд исследователей [1] так же отмечали отсутствие эталонных штаммов-референтов разных подвидов.
По результатам проведенного ДНК-маркирования имеющихся в нашем распоряжении культур с помощью различных типов ПЦР: генздовая (регистр. № ПВР-1-2.6/01846 от 20 февраля 2007 года) и мультиплексная [2,3] были выбраны две культуры, как наиболее характерные представители Fusobacterium necrophorum – это № 8TS630501 и № 12TSK630501, которые в последующем были депонированы в НИИ ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» под номерами соответственно В-1075 и B-1076 от 8 сентября 2005 года [4].
Штамм № 12TSK630501, депонированный в НИИ ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» под номером B-1076 выделен 02.12.95 года от больной первотелки Высокогорского района Республики Татарстан из хозяйства неблагополучного по некробактериозу. Получен бактериологическим и биологическим исследованием патологического материала методом отбора витальных срезов с последующей их микроскопией, постановкой биопробы на кроликах и изоляцией чистой культуры возбудителя на печеночной питательной среде (среда Китта-Тароцци) в анаэробных условиях. В мазках-отпечатках из патологического материала она имеет форму длинных, иногда переплетающихся, неравномерно окрашенных грамотрицательных нитей достигающих длины от 10 до 100 мкм или палочек. Для выращивания штамма используется среда Китта-Тароцци рН 7,2 – 7,6 в условиях термостата при температуре 37оС в бутылях – стационарно и в реакторах в среде, приготовленной на основе перевара Хоттингера под вазелиновым маслом. Для стимуляции роста используется нормальная сыворотка крупного рогатого скота до 10%.
Штамм по этим признакам идентифицирован по «Определителю микроорганизмов Берджи» [5], как вид Fusobacterium necrophorum.
Выделенный штамм бактерий некробактериоза вызывает хроническую инфекционную болезнь, характеризующуюся гнойно-некротическим поражением кожи, слизистых оболочек, конечностей и паренхиматозных органов.
Культуральные и морфологические особенности штамма: грамотрицательные нити и разной длины палочки, не спорообразующие, неподвижные, расположенные в виде сплетений. Они неподвижны и не образуют спор. Колонии на агарозированной среде росинчатые, серебристые, выпуклые, прозрачные, круглые, диаметром 2-4 мм; на кровяном агаре зона гемолиза 8-10 мм, агглютинирует эритроциты кур в разведении 1:128. Штамм обладает достаточной иммуногенностью, так в реакции непрямой иммунофлуоресценции с гомологичной сывороткой выявляет антиген в разведении 1: 5180.
Продуцирует индол и сероводород. Ферментирует с образованием масляной кислоты и незначительного количества газа глюкозу, сахарозу, мальтозу, манит, дульцин, инулин. Слабо ферментирует лактозу. Образовывает термолабильный экзотоксин, вызывающий гибель белых мышей на 1-2 сутки после их внутрибрюшинного заражения.
Активность (продуктивность) штамма. В среде Китта-Тароцци растет при +37ºС в течение 24 часов в виде обильного помутнения, в начале в нижних слоях, затем и всей среды. При последующем культивировании выпадает рыхлый осадок и среда становится прозрачной.
Способ определения активности штамма. При подкожном заражении суточной бульонной культурой белые мыши погибают на 4-5 сутки, кролики на 8-10 сутки с выраженным гнойно-некротическим поражением тканей на месте введения и обширными поражениями паренхиматозных органов (легкие, сердце, печень). В РНИФ с гемологичной сывороткой титр антигена 1: 5180, с гетерологичными – 1: 320 – 1: 640.
Условия и состав сред для длительного хранения штамма. В лиофилизированном и в нативном виде в среде Китта-Тароцци с добавлением 10% нормальной сыворотки крупного рогатого скота, а так же путем замораживания в питательной среде с добавлением глицерина.
Состав сред для размножения: среда Китта-Тароцци и добавлением 10% нормальной сыворотки крупного рогатого скота. Условия и состав среды для ферментации: В условиях термостата в бутылях – стационарно и в реакторах в среде, приготовленной на основе перевара Хоттингера под вазелиновым маслом с добавлением 10% нормальной сыворотки крупного рогатого скота, при температуре 37оС и рН – 7,2 – 7,6.
Генетические особенности и генотипирование штамма. Прототроф, в качестве фактора роста использует нормальную сыворотку, устойчив к стрептомицину, мономицину, неомицину.
Для определения подвида провели генотипирование с помощью полимеразной цепной реакции по синтезу фрагментов ДНК различных генов штамма. В качестве праймеров использовали первые и последние 18-20 нуклеотидов ниже приведенных нуклеотидных последовательностей. Затем осуществили секвенирование синтезированных фрагментов ДНК соответствующих фрагментов генов: белка оболочки, гемагглютинина, ДНК-гиразы и транспозазы. Определение нуклеотидной последовательности фрагментов проводят по двум цепочкам ДНК, используя общепринятую методику Максама-Гилберта [6]. При анализе нуклеотидных последовательностей фрагментов вышеназванных генов с прототипом было установлено, что фрагменты ДНК в 906 н.п. гена rpoB (RNA polymerase beta subunit), в 540 н.п. гена ompH (outer membrane protein gene) штамма НИИ ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» B-1076 совпадают с последовательностью Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum шт. ATCC25286 (AF527637).
Ген гемагглютинина отсутствует у Fusobacterium necrophorum subsp. funduliforme и Fusobacterium nucleatum. Нуклеотидная последовательность в 427 н.п. фрагмента гена фермента ДНК-гиразы (gyrase B subunit) штамма НИИ ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» B-1076 совпадала с нуклеотидной последовательностью штаммов Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum NCTC10576 (AY372007), Fn1 (AY370663) и Fusobacterium necrophorum subsp. funduliforme Fn45 (AY370665). Нуклеотидная последовательность ДНК в 557 н.п. гена транспозона (repeated DNA sequence) штамма НИИ ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» B-1076 совпадает с нуклеотидной последовательностью штамма FnS1 Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum (CAA48747, NCIBI), что подтверждает его отношение к семейству Fusobacterium. На основании результатов генотипирования по генам белка оболочки, ДНК-гиразы штамм НИИ ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» B-1076 отнесен к виду Fusobacterium necrophorum и по генам гемагглютинина и транспозона к подвиду necrophorum.
Для дополнительного подтверждения принадлежности штамма, депонированного в НИИ ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» под номером B-1076 к Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum провели ПДРФ-ПЦР анализ гена транспозазы. С этой целью ампликон внутреннего фрагмента в 289 н.п., синтезированного с помощью генздовой ПЦР ИЭВСиДВ (регистр. № ПВР-1-2.6/01846 от 20 февраля 2007 года) подвергли гидролизу эндонуклеазой MspI и проанализировали с помощью электрофореза в 2% агарозе. Маркером служила ДНК pUC18, гидролизованная AluI Полученный генетический профиль внутреннего фрагмента транспозона состоял из двух фрагментов длиной в 170 н.п. и 119 н.п., что подтвердило принадлежность штамма НИИ ККМ ГНЦ ВБ «Вектор» B-1076 к Fusobacterium necrophorum subsp. necrophorum.
Таким образом, использование микробиологических и биологических методов и ДНК-технологий позволило выделить культуру Fusobacterium, возбудителя некробактериоза животных и идентифицировать как Fusobacte-rium necrophorum subsp. necrophorum.
Литература:
1. Соломаха, О.И. Биотипы возбудителя некробактериоза и подбор штаммов для изготовления вакцины против некробактериоза животных/ О.И. Соломаха, Л.В. Кириллов, Н.Н. Кружнов, Е.Г. Лавченко, З.М. Межнева // Аграрная Россия. − 2000. − № 3. − C. 62-66.
2. Семенихин, В.И. Выявление возбудителя некробактериоза сельскохо-зяйственных животных с помощью гнездовой полимеразной цепной реакции /Донченко А.С., Юрик С.А. // Ветеринарная патология. Москва. – 2009. – № 1. – C. 86-90.
3. Семенихин, В.И. Дифференциация Fusobacterium necrophorum на подви-ды с помощью дуплексной одношаговой полимеразной цепной реакции/ Храпов Е.А., Юрик С.А., Филипенко М.Л. // Доклады РАСХН. – 2006. – № 1. – С. 51-53.
4. Семенихин, В.И. Биологическая и генетическая характеристика депони-рованных штаммов Fusobacterium necrophorum subspecies necrophorum / В.И. Семенихин, С.А. Юрик, Д.А. Хузин, Х.Н. Макаев // Состояние и перспективы ветеринарного благополучия Восточной Сибири: материалы науч.-практ. конф., посвящ. 45-летию ГНЦ НИИ вет. Вост. Сиб. СО Россельхозакадемии, 15–16 сент. 2008г. – Чита, 2008. – С. 148–152.
5. Определитель бактерий Берджи/ Под редакцией Дж. Хоулта, Н. Крига, П. Снита и др. − М.: Мир. − 1997. − Т. 1. − С. 295-300, 328-330.
6. Maxam F.M., Gilbert W. In: Methods in Ensymology. − 1980. − Vol. 65. − Part. I. − P. 499-550.
Источник: BORONA.net
