Изучение особенностей репликации вируса болезни Марека 3-го серотипа при различных режимах заражения
Ветеринарная медицина / 20 сентября 2012
Вирус болезни Марека 3-го серотипа также известный как вирус герпеса индеек (ВГИ) широко используется для профилактики болезни Марека у кур. Как показали наши ранние исследования метилирование CpG островков у герпес-вирусов кур 1-го и 3-го серотипов может существенно различаться и нести различную функциональную нагрузку.
Вирус болезни Марека 3-го серотипа также известный как вирус герпеса индеек (ВГИ) широко используется для профилактики болезни Марека у кур. Как показали наши ранние исследования метилирование CpG островков у герпес-вирусов кур 1-го и 3-го серотипов может существенно различаться и нести различную функциональную нагрузку.
Профиль метилирования, сильно влияющий на функциональное состояние гена, стабильно передается в ряду клеточных поколений. С этой точки зрения, для организмов с большой продолжительностью жизни и интенсивной тканевой регенерацией (позвоночные, растения) надежная система эпигенетической наследственности (типа метилирования ДНК) жизненно необходима.
Целью работы являлось изучение различных факторов влияющих на процессы репликации штамма ВГИ FC-126.
Материалы и методы:
Для исследований использовали нуклеотидные последовательности геномной ДНК вируса болезни Марека различных серотипов депонированные в «GenBank»: AF147806 EF523390 AF243438, DQ530438, AY510475, NC002641.
ПЦР в режиме реального времени с Sibrgreen II проводили на реалтайм-амплификаторе «MiniOptycon» (BioRad) в конечном объеме 25 мкл, содержащем 67 мМ трис.-HCl (рН 8,9), 16 мМ сульфат аммония; 2,4 мМ MgCl2; 0,01% Твин 20; 0,2 mM дНТФ; 0,5 mкM растворы олигонуклеотидных праймеров Hvt072 u 5-CGAGTACGCGCCGCAACTGA-3, Hvt072 r 5-CGGCGGTTCGCGCAGTGAAA-3, и 1ED Taq-полимеразы. Реакцию проводили с использованием следующего режима: начальная денатурация при 95°С 3 мин., далее в течение 45 циклов с денатурацией при 92° С 10 сек, отжигом при температуре 62 °C в течении 10 сек и синтезом при 72° С 10 сек. Флуориметрический учет реакции проводился на канале FAM при 82°С в конце каждого цикла. В конце реакции анализировалась кривая плавления, результаты амплификации верифицировали методом электрофореза в 6% ПААГ реакцию считали положительной при наличии ампликона длинной 168п.н. и пика кривой плавления 88°С.
Результаты собственных исследований и обсуждение
Исследовали культуры вируса подвергнутого деметилированию в присутствии 5-аза-дезоксицитидина (20 мМ), препараты вакцин и интактный вирус. В работе использовали первично-трипсинизированные культуры клеток фибробластов (CEF) 20 дневных развивающихся куринных эмбрионов (РКЭ) и эпителий почки цыпленка. Культуры клеток заражали ВГИ FC-126 в дозе 100 геномных эквивалентов (ГЕ) на 1см2 поверхности культурального планшета. В экспериментах использовали монослои CEF, вирус вводили непосредственно в суспензию первично-трипсинизированных CEF с последующим культивированием на среде, а также заражали клетки подвергнутые трем последовательным пассажам на среде МЕМ с пониженным содержанием глюкозы и 20мМ деметилирующего агента 5-аза-дезоксицитидина.
В случае заражения суспензии клеток штаммом ВГИ FC-126 на второй день клетки образовывали монослой и на третий день в монослое отмечалась цитопатическое действие вируса (контроль оставался неповрежденным), к четвертым суткам культивирования большая часть клеток округлялась и десквамировалась в питательную среду.
Культивирование вируса в присутствии 5-аза-дезоксицитидина (химического агента ингибирующего активность метилаз) сопровождалось аналогичными морфологическими изменениями и сроками проявления цитопатического эффекта как и в контроле.
В качестве контроля культивирование вируса в монослое CEF проводили без введения 5% эмбриональной сыворотки на среде МЕМ с пониженным содержанием глюкозы. Гибель большей части клеток отмечалась на пятый день культивирования.
При достижении 50% гибели клеток клетки находящиеся в культуральной жидкости и в монослое извлекали из лунок планшетов, центрифугировали и выделяли ДНК силикосорбционным методом.
Изучение концентрации вируса ВГИ проводили на основе оригинальной методики. Праймеры предложенные нами были комплементарны гену ВГИ Hvt 072 (локализующемся в положении 126451 - 126701п.н. геномной ДНК FC-126).
Помимо достаточной специфичности, чувствительности и линейности (см. рис.) преимуществом нашей методики являлась возможность изучения метилирования CpG сайтов входящих в состав гена Hvt 072 методом метилчувствительной ПЦР с использованием метилчувствительной рестриктазы Hpa II и метилрезистентной рестриктазы Msp I.
Рис. Кинетика накопления ампликонов при проведении ПЦР в режиме реального времени при различной концентрации геномной ДНК FC-126
При изучении специфичности реакции специфический ампликон и специфический пик кривой плавления обнаруживался только при наличии геномной ДНК ВГИ
Таблица 1. Результаты эксперимента с различными режимами заражения вирусом FC 126 культуры клеток CEF
|
пробы
|
n
|
Концентрация вируса ГЕ/мкл
|
|
Заражение одновременно с инокуляцией клеток
|
5
|
1,82х106 + 4,84х104***
|
|
Концентрация вируса при культивировании в присутствии 20мМ
5-азадезоксицитозин
|
10
|
3,53х102 + 152,5***
|
|
Заражение сформировавшегося монослоя
|
5
|
1,67х105+ 5,2х104
|
Примечание: *** P>0.999, **P>0.99, *P>0.95
Как следует из таблицы 1 отмечалась достоверная разница в концентрации ВГИ при заражении суспензии первично-трипсинизированных клеток CEF, мы объясняем этот феномен тем, что при попадании в клетку вирусу для начала репликации необходимо проникнуть еше и в ядро, активноделящиеся клетки на стадии образования метафазной пластинки теряют ядерную оболочку, что обеспечивает доступ вирусной ДНК внутрь ядра, помимо этого активно делящиеся клетки соответственно обладают набором необходимых для репликации вирусной ДНК ферментов и субстратов. Клетки, подвергнутые деметилированию, напротив обеспечивали низкую концентрацию вируса в культуре клеток, соответственно, это может быть объяснено как репрессией необходимых для репродукции вируса ВГИ биохимических процессов внутри клетки, так и подавлением некоторых функций самого вируса (второй вариант согласовывается с нашими ранними исследованиями указывающими на наличие большей функциональной значимости CpG островков для вируса ВГИ по сравнению с ВБМ 1-го серотипа.
Таблица 2 Статус метилирования вакцинного штамма FC 126
|
Вид материала
|
n
|
M+m
|
|
ДНК Fc126 предварительно рестриктированная HpaII, C(t)
|
10
|
29,63+0,63
|
|
ДНК Fc126 предварительно рестриктированная MspI, C(t)
|
10
|
28,563+0,094
|
|
Соотношение ингибирующей активности обработки метилчувствительной и метилрезистентной рестриктазами HpAII/MspI dC(t)
|
10
|
1,07+0,553
|
|
Средняя концентрация вируса в пробах ГЕ/100мл
|
10
|
2,02х1010 +7,81х109
|
Примечание: *** P>0.999, **P>0.99, *P>0.95
Как следует из таблицы 2 вакцинный вирус ВГИ FC 126 имеет изначально деметилированный сайт рестрикции HpaII/MspI т.к. статистически достоверных различий в ингибировании реакции метилчувствительной и метилрезистентной рестриктазами нет.
Заключение
Обнаружено статистически значимое увеличение концентрации вируса при заражении активно делящихся культур клеток что может быть использовано при производстве вакцины и вирусологических исследованиях.
Источник: BORONA.net
