Особенности диагностики респираторных болезней крупного рогатого скота, вызываемых РНК-содержащими вирусами
Ветеринарная медицина / 04 октября 2013
Респираторные болезни молодняка крупного рогатого скота наносят огромный экономический ущерб промышленному скотоводству. Наиболее часто этиологическую роль в возникновении данной патологии играют вирусы, содержащие в своем составе РНК: вирус вирусной диареи-болезни слизистых оболочек, парагриппа-3, респираторно-синцитиальной инфекции, а также коронавирус. Они способны вызывать поражение респираторного тракта и лимфоидной системы восприимчивых животных самостоятельно (в моноварианте), а также в различных ассоциациях между собой.
Эти возбудители могут вызывать широкий спектр клинических проявлений у крупного рогатого скота, зависящий от взаимоотношений в системе вирус-организм восприимчивого животного, а также условий внешней среды: острые, подострые, субклинические, рецидивирующие инфекции респираторного тракта, глаз, иммунной системы, а также латентные формы. Острые инфекции варьируют от инаппарантных до тяжелых.
При планировании профилактических мероприятий большая роль принадлежит оперативной и точной лабораторной диагностике, направленной на расшифровку этиологической структуры конкретной вспышки респираторных болезней и выяснения этиологической роли каждого инфекционного агента.
Предварительный диагноз на вирусные болезни может осуществляться на основании анализа эпизоотологических данных, клинических признаков болезней и результатов патологоанатомического вскрытия трупов животных, павших или убитых с диагностической целью. Однако окончательный диагноз ставится только лабораторными методами. В связи с убиквитарностью многих возбудителей вирусной природы и полиэтиологической структурой респираторных болезней эпизоотологический диагноз носит только предварительный характер.
Как правило, вирусы проявляют патогенетическое действие на ранней стадии респираторных болезней, в среднем длящейся не более 10-14 дней, после чего они, открыв «входные ворота» для бактерий, могут либо элиминироваться из организма животного, либо перейти в латентное состояние, находясь в организме в скрытом состоянии и бывают не доступны воздействию антител и др. В это время происходит активизация и усиленное размножение бактериальных агентов, из которых многие являются условно-патогенными и не могут самостоятельно вызвать респираторную болезнь. При лабораторных исследованиях в случае выделения только бактерий будет ошибочно поставлен диагноз на бактериальные инфекции без определения ведущих вирусных патогенов, играющих роль «пускового механизма» и имеющих большое значение в эпизоотологии смешанных инфекций.
При проведении диагностики смешанных болезней необходимо иметь четкие представления о биологических свойствах возбудителей, участвующих в их этиологии, особенностях патогенеза моно - и смешанных инфекций, а также изучить эпизоотическую ситуацию по инфекционным болезням в конкретной популяции животных, клинические проявления и данные патологанатомического вскрытия трупов животных.
Результаты лабораторных исследований необходимо тщательно интерпретировать и иметь в виду, что никакой диагностический тест не даст правильный ответ при всех ситуациях, и что от правильного выбора его будет зависеть эффективность противоэпизоотических мероприятий.
Для диагностики вирусных инфекций наиболее пригодны простые и недорогие методы, позволяющие быстро исследовать большое число проб биоматериала. Помимо установления этиологии заболевания, лабораторная диагностика имеет существенное значение в организации противоэпизоотических мероприятий. Ранняя диагностика первых случаев проявления вирусных болезней позволяет своевременно организовать и провести профилактические мероприятия. Реализация программ вакцинации вирусных инфекций, а также программ их эрадикации, которые реализуются в некоторых странах Европы, невозможны без тщательно спланированных программ диагностических исследований, роль которых при респираторных болезнях животных постоянно возрастает.
В связи с тем, что многие возбудители вирусной природы могут постоянно присутствовать в популяции восприимчивых животных, в лабораторной диагностике вирусных инфекций используются три основных принципа:
1. Выявление антигенов вируса или его нуклеиновых кислот непосредственно в исследуемом материале от животных;
2. Выделение и идентификация вирусов из проб биоматериала от больных животных;
3. Ретроспективная серологическая диагностика болезней, основанная на установлении диагностического (4-х и более кратного) прироста титров специфических антител к вирусам при исследовании парных проб сыворотки крови (сероконверсиия), свидетельствующая об активной вирусной инфекции.
При любом выбранном подходе к лабораторной диагностике вирусных инфекций основным требованием являются сроки отбора и качество биоматиериала, отобранного от животных. Для прямого анализа проб биоматериала или выделения вируса исследуемый материал должен быть получен в самом начале заболевания, когда возбудитель еще выделяется от инфицированного животного в относительно больших количествах и не связан с антителами. Объем проб должен быть достаточен для проведения прямого исследования. Важно также определить источник отбора проб биоматериала в соответствии с предполагаемым заболеванием, т. е. тех органов или тканей организма, в которых, исходя из патогенеза болезни, вероятность присутствия вируса наиболее высока. Большую роль в успешной диагностике играют условия транспортировки биоматериала, вид транспортной среды и его хранение. Пробы биоматериала должны отбираться не позднее 4-х часов после гибели или вынужденного убоя животных и транспортироваться в диагностическую лабораторию в замороженном состоянии в термосе со льдом.
Для установления сероконверсии первая проба сыворотки крови должна отбираться на ранних стадиях проявления болезней (не позднее 3-5 дней после появления первых клинических признаков), а вторая в период выздоровления или реконвалесценции через 3-4 недели после отбора первой пробы. Первая проба хранится в замороженном виде до взятия второй, транспортируются они в лабораторию вместе, где исследуются одномоментно. Пробы сыворотки крови должны отбираться в стерильные пробирки, не должны быть гемолизированы, контаминированы бактериальной флорой и не содержать консервантов. Транспортировка их должна осуществляться в замороженном виде в термосе со льдом.
Прямые методы диагностики вирусных болезней — это методы, позволяющие обнаружить вирус, его антиген или нуклеиновую кислоту непосредственно в пробах биологического материала, являющиеся наиболее быстрыми (2—24 ч). К ним относятся: электронная микроскопия, метод флуоресцирующих антител (МФА), иммуноферментный анализ (ИФА), радиоиммунный анализ (РИА) и полимеразная цепная реакция (ПЦР). Однако эти методы имеют свои ограничения, поскольку существует возможность получения ложноположительных и ложноотрицательных результатов. Поэтому они требуют подтверждения непрямыми методами. Как правило, использование этих методов регламентируется массовыми (скрининговыми) исследованиями, а результаты их носят предварительный характер.
Непрямые методы диагностики вирусных болезней. К ним относятся: выделение и идентификация вирусов в чувствительных биологических системах (культуры клеток, куриные эмбрионы, лабораторные животные), а также реакция нейтрализации вируса, проводимая с использованием этих же систем.
Выделение вируса по-прежнему остается стандартным или референтным методом вирусологической диагностики и дает информацию для решения многих вопросов. С использованием этого метода удается расшифровать этиологию болезни, установить циркуляцию вирусов среди обследуемой популяции крупного рогатого скота, получить информацию об эпизоотической ситуации в стаде животных на конкретной территории. Однако он является дорогостоящим и трудоемким.
Идентификация вирусов. После выделения вируса проводится его идентификация, предусматривающая определение его таксономической принадлежности. Для этого используют прямые, а в основном, серологические методы.
Непрямые методы идентификации выделенных цитопатогенных агентов проводятся на первых этапах исследований и носят ориентировочный характер. К ним относятся: электронная микроскопия, полимеразная цепная реакция и другие.
Референтными методами идентификации выделенных вирусов считаются серологические методы, к которым относят реакцию нейтрализации, реакцию связывания комплемента, реакцию диффузионной преципитации, реакцию гемагглютинации и торможения гемагглютинации (для гемагглютинирующих вирусов), метод флуоресцирующих антител и некоторые другие.
Полная идентификация возможна только при наличии референнтных моноспецифических сывороток (поли- или моноклональных).
Перспективным методом идентификации выделенных вирусов в настоящее время является полимеразная цепная реакция, секвенирование, иммуноблоттинг, моноклоналные антитела и некоторые другие.
Проблемы диагностики инфекций крупного рогатого скота, вызываемых РНК-содержащими вирусами. В настоящее время для диагностики ВД-БС, ПГ-3, РСИ и коронавирусной инфекции обычно используют выделение вируса в культурах клеток. Для прямого обнаружения - выявление антигенов в гистологических срезах или секретах организма (иммуногистохимия или ИФА) и выявление их РНК при помощи классической ПЦР или ПЦР в режиме реального времени. В связи с тем, что промежуток времени для классических вирусологических методик ограничен несколькими днями после появления первых клинических признаков инфекции, при помощи ПЦР можно выявлять РНК вируса в течение двух недель. Кроме этого существует техника электронной микроскопии, которая не доступна рутинным диагностическим лабораториям, а также реакция гемадсорбции в культуре клеток, которые также чаще используются для научно-исследовательских целей.
Для выделения этих вирусов используют первично-трипсинизированные культуры клеток слизистой оболочки плода коровы, легких, почек и других.
Слабая устойчивость РНК-содержащих вирусов представляет большую проблему при проведении процедуры выделения вируса в культурах клеток, поскольку эффективность их выделения зависит от жизнеспособности вируса, доставленного в лабораторию. Несмотря на высокую чувствительность метода выделения вируса, количество дней после инфекции, в которые вирус жизнеспособен, ограничивается несколькими днями. Выделение этих вирусов основано на их способности вызывать специфическое ЦПД в виде лизиса клеток (ПГ-3, коронавирус) или образовании синцитиев (РСИ), образовывать внутриплазматические тельца-включения (вирусы РСИ и ПГ-3) с последующей идентификацией при помощи моноспецифических сывороток. Их выделение всегда затруднено в связи с наличием в исследуемой пробе других вирусов, обладающих более высокой способностью к репликации в чувствительных культурах клеток, вследствие чего происходит подавление репликации вирусов РСИ, ПГ-3 и корона другими вирусами, например, вирусом ИРТ КРС. Выделение вирусов этой группы может быть эффективным только при полной гарантии того, что животное в момент отбора проб было инфицировано именно этим вирусом, и они были правильно отобраны и доставлены в лабораторию. В связи с этим вирусологическая диагностика обладает слабой эффективностью, что может искажать истинную роль этих вирусов в этиологии массовых респираторных болезней телят. Поэтому в настоящее время значительно возрастает роль ПЦР при выявлении и идентификации РНК-содержащих вирусов в пробах биоматериала от животных и инфицированных культурах клеток.
Литература:
1. Медицинская вирусология: Руководство/Под. ред. Д.К. Львова-М:ООО «Медицинское информационное агенство», 2008.-656 с.
2. Строганова И.Я. Культивирование респираторно-синцитиального вируса крупного рогатого скота с целью получения диагностических препаратов/И.Я.Строганова// Автореф. дисс. … канд. ветеринар. наук.- Москва.- 1988.- 20 с.
3. Сюрин В.Н. Диагностика вирусных болезней животных: Справочник / В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина// М.: Агропромиздат, 1991.- 528 с.
4. Brogden K. A., Guthmiller J. M. Polymicrobial Diseases/ Brogden K. A., Guthmiller J. M.//.-2002 ASM Press.- 328 p.
5. Hagglund S. Epidemiology, Detection and Prevention of Respiratory Virus Infections in Swedish Cattle with Special Reference to Bovine Respiratory Syncytial Virus/Faculty of Veterinary Medicine and Animal Science Department of Clinical Sciences Uppsala// Doctoral thesis Swedish University of Agricultural Sciences.-Uppsala.- 2005.
6. Kelling C.L. Testing and management Strategies for effective beef and dairy herd BVDV biosecurity programs/C.L. Kelling, D. Grotelueschen et al.//Bovine Practitioners.- 2000.-Vol.34.-P.13-22.
7. Saliki J.T. Laboratory diagnosis of bovine viral diarrhea virus infections/ Saliki JT, Dubovi EJ.//Vet Clin North Am Food Anim Pract.- 2004.- 20.-pp. 69–83.
Источник: BORONA.net
